Scuola di Specializzazione in

ANESTESIA E RIANIMAZIONE

Direttore: Prof. ALESSANDRO GASPARETTO
TESI DI SPECIALIZZAZIONE

I METABOLITI GLUCURONIZZATI DELLA MORFINA NEI SOGGETTI IN TRATTAMENTO CON OPPIACEI

RELATORE

Prof. Alessandro Gasparetto

SPECIALIZZANDA

Dott. Antonia Renzi

CORRELATORE

Prof. Consalvo Mattia

ANNO ACCADEMICO 1999/2000  

INTRODUZIONE

L'uso della morfina nel dolore cronico da cancro è consigliato dall'OMS fin dagli anni '80. Nonostante abbiamo assistito ad un aumento dell'uso di morfina in tutto il mondo, l'Italia resta il paese con il più basso utilizzo di morfina per motivi sia culturali, sia legislativi. Del tutto recentemente si è osservata una maggiore attenzione verso la problematica del trattamento del dolore cronico e dell'utilizzo della morfina. Modificazioni legislative sull'uso degli stupefacenti, e quindi la possibilità di prescrizioni più numerose, dovrebbero accrescere anche in Italia il suo uso. Tutto ciò ha condotto ad un sempre maggiore interesse verso lo studio di questo farmaco, per ottenerne il miglior utilizzo e, soprattutto, superare quella barriera culturale che fino ad oggi ha contribuito ad ostacolarne l'impiego.

Ancora molti sono gli aspetti sconosciuti della farmacologia della morfina. La completezza delle conoscenze è resa difficile dal fatto che la morfina possiede una farmacologia complicata dalla presenza di metaboliti attivi e da un'estrema variabilità farmacologica inter-individuale. Nel nostro studio abbiamo deciso di analizzare le concentrazioni urinarie dei metaboliti della morfina (M3G e M6G) in un gruppo di pazienti sottoposto a trattamento cronico con il farmaco, in collaborazione con l'Istituto di Farmacologia dell'Università "La Sapienza" di Roma, diretto dal prof. P.Nencini.

L'obiettivo dello studio è stato quello di valutare l'eventuale variazione del rapporto tra i metaboliti morfinici, M6G/M3G, prodotti nei pazienti in trattamento cronico con morfina. Questo gruppo sarà anche utilizzato come gruppo di controllo verso soggetti che assumono eroina, onde valutare se vi sono differenze significative nel rapporto dei metaboliti prodotti. Al momento attuale la numerosità del campione è ancora troppo esigua per trarre delle conclusioni statisticamente significative, ma le prime indagini fanno presumere che possa esserci una differenza nella distribuzione percentuale dei due metaboliti. Infatti, nel gruppo dei pazienti eroinomani, la M6G è in quantità maggiore.

Se questo dato sarà confermato, si dovrà indagare sulla possibile causa di questa modificazione, che potrebbe essere determinata dal tipo di oppioide (morfina/eroina), da una modificazione del metabolismo, da variazioni genetiche o da un insieme di concause. Questi particolari aspetti saranno, tuttavia, oggetto di una successiva comunicazione.

FARMACOLOGIA

La morfina è il principale alcaloide fenantrenico contenuto nell'oppio, lattice che sgorga dalle incisioni praticate nella capsula matura del Papaver Somniferum varietà album . L'oppio contiene principi attivi debolmente basici o alcaloidi, a struttura fenantrenica: la morfina , la codeina (o 3-metilmorfina), la dionina (3,6-dietilmorfina) e alcaloidi isochinolinici , non analgesici, come la papaverina , la noscapina , la tebaina , usati, sia pur raramente, per le proprietà spasmolitiche ¹⁹ . Nella sua struttura chimica, la morfina (Fig. 5) ha due siti idrofilici: il gruppo in posizione 3 sull'anello aromatico e un gruppo idrossi-alcolico in posizione 6. ³¹

Alterazioni della struttura chimica della morfina provocano cambiamenti nell'attività farmacologica, che possono avere importanti sequele cliniche. Il gruppo idrossile può essere convertito sia in estere, sia in etere e questi cambiamenti alterano l'attività clinica (eroina, diacetilmorfina). I cambiamenti sui gruppi idrossilici determinano effetti opposti: i legami al gruppo3-idrossile fenolico riducono l'attività farmacologica, forse più del 90% ²⁶ . Di contro, modificazioni in posizione del gruppo 6-idrossile alcolico determinano un'attivazione della molecola, formando così un composto da 2 a 4 volte più potente della morfina dopo somministrazione parenterale ³² . Il carattere terziario dell'atomo di azoto è cruciale per l'attività analgesica della morfina. Modificazioni chimiche, che trasformano l'azoto terziario in quaternario (es. con un N-ossido), riducono notevolmente la potenza analgesica riducendo la capacità di penetrazione della molecola nel SNC ²⁶ .

Grazie alla loro favorevole posizione nell'ambito della struttura, sono i gruppi idrofilici che subiscono maggiormente l'azione degli enzimi nella metabolizzazione della morfina. Si tratta di enzimi glucuroniltransferasi, che catalizzano la reazione di glucuronizzazione di metaboliti, i quali contengono nella loro struttura gruppi idrossilici (ROH-alcolico; PhOH-fenolico) o un gruppo carbossilico (RCO 2 H-acidi) ²¹ . La coniugazione del gruppo 3-idrossilico avviene in molti mammiferi, mentre la glucuronizzazione in posizione 6 avviene solo nell'uomo ²¹ .

La glucuronizzazione avviene in posizione 3- e in posizione 6- producendo la morfina-3-glucuronide (M3G) e la morfina-6-glucuronide (M6G). I glucuronidi della morfina si formano per azione di un enzima, che catalizza il trasferimento di acido glucuronico dall'acido difosfoglucuronico (UDP); gli enzimi responsabili sono delle glucuroniltransferasi microsomiali (UDPGT), una serie di enzimi funzionalmente distinti trovati nel fegato, rene, intestino ed altri organi. I prodotti della glucuronizzazione sono escreti con le urine e la bile. L'escrezione urinaria o biliare dipende dal peso molecolare e polarità della molecola. Composti ad alto peso molecolare (più di 300 Da) e a bassa idrosolubilità sono più spesso escreti con la bile. I glucuronidi della morfina, essendo molto idrosolubili, sono escreti con le urine.

Dechelotte et al. (1993) hanno evidenziato che la morfina è glucuronizzata a M3G dalle cellule gastriche, intestinali, epatiche, e a M6G da tutte le cellule, eccetto quelle gastriche. Studi su campioni di urina hanno evidenziato che nell'uomo più del 90% della dose di morfina somministrata nelle 24 ore è escreta nelle urine. Solo il 10% è rappresentata da morfina, il 70% dai glucuronidi, di cui la M3G rappresenta il maggior metabolita; la M6G invece è un metabolita minore, rappresentando meno dell'1% della dose, il 10% dai 3-solfati, l'1% dalla normorfina e il 3% dalla normorfina glucuronide. Nel plasma sono stati identificati solo la M3G e la M6G.

Studi in anni recenti hanno evidenziato che i due glucuronidi della morfina, la M3G e la M6G, possono giocare un ruolo significativo nelle risposte dinamiche nella terapia morfinica. La 6-monoacetilmorfina, la morfina, la morfina-6-glucuronide e la normorfina (Christensen & Jorgensen, 1987) si legano ai recettori degli oppioidi e possiedono un'attività analgesica intrinseca; probabilmente la M6G agisce anche su altri recettori. La M3G ha effetti stimolatori sul SNC non mediati dai recettori degli oppioidi e, di conseguenza, non possiede attività analgesica, sebbene sia stata dimostrata una sua attività eccitatoria; potrebbe essere responsabile di alcuni effetti collaterali della morfina come l'allodinia, l'iperalgesia e la comparsa di mioclono ²³ .

Contrariamente alla M3G, la M6G ha un effetto analgesico dimostrato: è circa 45 volte più potente della morfina, somministrata per via intracerebroventricolare, ed è circa quattro volte più potente nella somministrazione sottocutanea ²⁴ . Durante somministrazione cronica, la M6G può dare un significativo contributo all'effetto analgesico ²⁶ . Durante il trattamento cronico con morfina nei pazienti neoplastici, il rapporto AUC (area sotto la curva concentrazione/tempo) tra morfina-6-glucuronide e morfina è approssimativamente di 3:1. Un simile rapporto è stato evidenziato anche in studi con singola dose di morfina in soggetti volontari sani ²⁵ . Tuttavia, questo rapporto non è stato ben definito ed alcune evidenze sperimentali suggeriscono che la produzione di morfina-6-glucuronide può essere profondamente influenzata dalla via di somministrazione ²⁵ .

Dopo somministrazione parenterale di morfina, studi della farmacocinetica della M6G hanno suggerito che la produzione dei metaboliti può essere ridotta in queste circostanze. Di contro, è stato osservato un rapporto AUC della M3G rispetto alla morfina più elevato dopo somministrazione orale ed e.v. ²⁵ . In seguito alla somministrazione e.v. di morfina, questa è presente in quantità misurabile da 4 a 6 ore dopo la somministrazione in tutti i soggetti volontari, persistendo fino a 10 ore dopo la somministrazione. Un aumento secondario dei livelli di morfina, che poteva suggerire un ricircolo enteroepatico di morfina, non è stato osservato. Il metabolismo della morfina nei suoi glucuronidi procede rapidamente e nella maggioranza dei soggetti già dopo 5 minuti dalla somministrazione sono dosabili quantità di M6G e di M3G ²⁵ . I livelli plasmatici di M3G e M6G eccedono quelli della morfina già a 0.1 ora e a 0.5 ore rispettivamente dopo la somministrazione. Il picco dei livelli dei metaboliti si ha rapidamente per la M3G, ma la massima concentrazione plasmatica (Cmax) di M6G si ha significativamente più tardi. In seguito all'intenso metabolismo della morfina, solo il 10% della dose somministrata si ritrova nelle urine sotto forma di morfina libera.

Dopo somministrazione orale di morfina, la farmacocinetica è marcatamente differente rispetto a quella osservata in seguito a somministrazione parenterale. L'assorbimento è molto rapido, con picco dei livelli dopo 15 minuti, implicando una rapida dissoluzione delle compresse e l'entrata della morfina nel piccolo intestino ²⁵ . Vi è evidentemente un ritardo di comparsa nel plasma della morfina; inoltre, la quantità è più bassa rispetto a quella osservata nella terapia ev., la Cmax raggiungendo solo i 20 nmol/L, paragonata ad una concentrazione di 273 nmol/L a 5 minuti dalla somministrazione ev ²⁵ .

Dopo somministrazione orale si evidenzia una quantità di metaboliti molto simile a quella osservata dopo somministrazione e.v. e la morfina-6-glucuronide, nonché la morfina-3-glucuronide sono presenti in quantità simili a quelle trovate dopo morfina e.v.. Il rapporto AUC della morfina-6-glucuronide rispetto alla morfina, dopo somministrazione orale, è di 9.7:1, considerevolmente più elevato del 3:1 osservato nei pazienti neoplastici o nei soggetti sani dopo somministrazione e.v.; il rapporto rispetto alla morfina-3-glucuronide è di 56:1 ²⁵ .

Svesson et al. (1982), con la tecnica di cromatografia ad alta risoluzione (HPLC), hanno misurato simultaneamente la molecola di morfina e i suoi 3- e 6-glucuronidi. Queste analisi sono state facilitate dall'alta concentrazione presente nel plasma di pazienti in trattamento con alte dosi di morfina. La disponibilità sistemica della morfina in volontari e in pazienti con dolore da cancro è variabile tra il 19% e il 47%. ¹ Questa grande variabilità nella biodisponibilità è probabilmente uno dei fattori che causano l'enorme variazione interindividuale della dose richiesta nel trattamento del dolore. In teoria, la maggior parte dei pazienti dovrebbe ottenere un completo sollievo dal dolore quando essi ricevono una sufficiente quantità di morfina; in pratica, l'aumento della dose è spesso limitato dal manifestarsi di effetti collaterali, in particolare la sedazione.

Un obiettivo realistico nella terapia morfinica è quello di ottenere un bilanciamento tra il sollievo dal dolore e gli effetti collaterali, basato sulla risposta individuale del singolo paziente. La dose individuale somministrata viene poi regolarmente rivista e aumentata in modo graduale fino ad ottenere un buon controllo del dolore, seguendo lo schema dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. Ma la differente azione dei diversi metaboliti e le modificazioni del loro rapporto percentuale, che seguono alla diversa via di somministrazione, ci hanno spinto a valutare la comparsa di eventuali variazioni di questo rapporto dopo terapia cronica, mantenendo inalterata la via di somministrazione prescelta, cioè quella orale.

Farmacocinetica

La morfina è una base debole con un pKa intorno a 9 e modesta solubilità nei lipidi; si lega scarsamente all'albumina del plasma ed è soggetta a processi di glicuronoconiugazione e di N-demetilazione già nelle cellule mucose, che tappezzano l'intestino tenue, e soprattutto nel fegato ¹⁹ . Dopo l'iniezione endovenosa (e.v.) o l'assorbimento ematico , un oppioide è immediatamente influenzato dal pH ivi vigente e dalla sua tendenza a legarsi a proteine plasmatiche. Per indurre i propri effetti farmacologici, il farmaco deve lasciare il plasma, diffondere nei tessuti, raggiungere i recettori e attivarli.

Diversi fattori favoriscono il movimento di un farmaco verso la propria destinazione: un ridotto legame proteico, una bassa ionizzazione ed un'alta liposolubilità. Nel plasma la sola frazione del farmaco non legata a proteine e non ionizzata, la cosiddetta frazione diffusibile , è libera di lasciare il compartimento ematico. La frazione diffusibile determina il gradiente iniziale di concentrazione e, quindi, la velocità di diffusione. L'altro fattore che determina la velocità di passaggio del farmaco dal plasma e dal liquido extracellulare nei tessuti è la liposolubilità. Per un rapido accesso nel SNC un oppioide deve possedere sia un'alta frazione diffusibile, sia un'elevata liposolubilità. Il prodotto tra la frazione diffusibile e la liposolubilità di un oppioide è noto come potenziale di diffusione nel SNC ¹ .

In relazione alle caratteristiche farmacocinetiche della morfina, sia i livelli plasmatici, sia la sua ripartizione negli organi e negli escreti dipendono dalla via di somministrazione. La via orale fornisce picchi plasmatici corrispondenti a 1/8 della via sottocutanea e a 1/10 della via endovenosa, per la rapida metabolizzazione intestinale ed epatica ¹⁹ .

Dopo un bolo e.v. di fentanile, invece, l'oppioide entra nei tessuti del SNC rapidamente, poiché ha un elevato potenziale di diffusione. Quando la concentrazione plasmatica decade, a causa del passaggio del farmaco nei tessuti e della sua biotrasformazione, il gradiente si inverte e il fentanile lascia altrettanto rapidamente questi tessuti. La morfina ha il potenziale di diffusione più basso tra tutti i comuni oppioidi, sicché risulta un certo ritardo tra la somministrazione e.v. di morfina e il raggiungimento delle massime concentrazioni cerebrali e quindi dell'esordio degli effetti. Una volta che la morfina è penetrata nel SNC, la diffusione retrograda verso il plasma è lenta.

Una volta che una precisa concentrazione di oppioide è stata raggiunta nel plasma, nel liquor o nel SNC, l'effetto finale non è uguale per ogni individuo; esiste infatti un'ampia variabilità tra individui rispetto alla Minima Concentrazione Analgesica Efficace (MEAC) per ciascun oppioide. La MEAC è la concentrazione plasmatica più bassa di un oppioide, in grado di controllare un dolore intenso di un certo paziente. ¹ La morfina ha una MEAC media di 16 ng/ml con un range da 6 a 32 ng/ml. Se gli oppioidi avessero solo proprietà analgesiche, sarebbe facile assicurare l'analgesia a tutti i pazienti semplicemente mantenendo delle concentrazioni plasmatiche, che siano due o tre deviazioni standard al di sopra della MEAC media.

Sfortunatamente, questi farmaci hanno molti effetti sull'organismo: ad esempio, nausea, sedazione, vertigini, che si manifestano a concentrazioni plasmatiche appena superiori alla MEAC di ciascun paziente. Quindi, la “finestra terapeutica” per l'analgesia è molto ristretta. Il controllo ottimale del dolore intenso si può raggiungere solo mantenendo la concentrazione plasmatica dell'oppioide ad un valore costante, appena al di sopra la MEAC per quel paziente ¹ . Tutto ciò sottolinea la necessità di individualizzare la dose di un oppioide in base alla risposta ed ai bisogni di ogni singolo paziente. La MEAC di ogni paziente varia con l'intensità del dolore; un dolore molto intenso avrà una MEAC superiore alla MEAC necessaria per controllare un dolore moderato.

I meccanismi specifici responsabili di queste differenti risposte cliniche non sono ben chiari e, presumibilmente, sono il risultato dell'interazione tra le caratteristiche del farmaco, la via di somministrazione, l'età, le condizioni metaboliche del paziente e l'uso concomitante di altri farmaci ¹ . Lo studio delle relazioni tra picco plasmatico e analgesia ha mostrato che, dopo morfina, il massimo sollievo dal dolore si manifesta poco dopo il picco, si mantiene ad un livello intorno a 0.5 m g/ml e quindi declina con la caduta della concentrazione nel plasma. Alla 4 a ora dalla somministrazione, si raggiunge nel plasma la massima concentrazione del prodotto di coniugazione della morfina con l'acido glucuronico (M3G), mentre, data la sua inattività farmacologica, l'analgesia cessa. 33

Gli oppioidi agonisti m non hanno effetto “tetto” per l'analgesia. L'effetto “tetto” dipende esclusivamente dalla comparsa di effetti collaterali incontrollabili. Tale variabilità nell'espressione degli effetti clinici degli oppioidi è definita dal concetto della “responsività” agli oppioidi. Tale termine può essere definito come il grado di analgesia ottenuto con dosi progressive di oppioide sino ad un punto definito dalla comparsa di effetti collaterali severi ed incontrollabili , ovvero la probabilità che un paziente otterrà un favorevole rapporto analgesia/effetti collaterali con un appropriato incremento del dosaggio ¹⁷ .

La responsività può variare per la presenza di fattori relazionati al paziente, al farmaco adoperato e al tipo di dolore ¹⁷ . Per esempio, l'età avanzata e l'insufficienza di organi deputati al metabolismo dei farmaci sono fattori relazionati al paziente, che possono aumentare la probabilità di effetti collaterali e, quindi, ridurre la responsività. L'età influenza anche i livelli plasmatici di morfina, poiché, sopra i 50 anni, nei primi minuti dalla somministrazione parenterale i livelli plasmatici sono anche 4 volte maggiori rispetto alle età inferiori. Anche la durata dell'analgesia è pressoché raddoppiata negli anziani.

Fattori legati al tipo di dolore possono essere le caratteristiche temporali di estrinsecazione e la presenza di un meccanismo neuropatico. I dolori cronici sostenuti da meccanismi non nocicettivi (cioè non legati ad una lesione tissutale), e particolarmente quelli considerati neuropatici, sembrano meno responsivi agli oppioidi di quelli a componente nocicettiva pura ²⁰ .

MECCANISMO D'AZIONE

Gli effetti degli oppioidi sono mediati da recettori specifici localizzati sulle membrane neuronali. Non è chiaro se questi recettori siano costantemente presenti sulla membrana cellulare o se il loro tipo e numero sia influenzato da differenti condizioni; per esempio, sulla membrana dei nocicettori sinoviali i recettori oppioidi non sono normalmente presenti, ma si riscontrano in presenza di una flogosi articolare 1 . Nel SNC questi recettori sono stati identificati sia a livello pre, che postsinaptico (Fig. 1). I singoli farmaci oppioidi hanno diversa affinità per ciascuno di questi recettori, che a loro volta hanno una distribuzione eterogenea nell'organismo.

La definizione di recettore e la sua struttura sono stati chiariti solo in questi ultimi anni: il recettore è una macromolecola con cui una sostanza, il “ligando”, interagisce per produrre i caratteristici effetti farmacologici ¹ . La loro struttura è rappresentata da molecole dette “seven spanning trasfering”, cioè molecole che attraversano sette volte lo spessore della membrana cellulare (Fig.2; Fig.3). L'azione di questa macromolecola è mediata da:

a) un sito recettoriale o di legame, che interagisce con il ligando, in questo caso una molecola oppioide;

b) un meccanismo effettore o trigger, che attiva una serie di sequenze biochimiche, le quali conducono all'effetto finale degli oppioidi a livello neuronale.

L'interazione tra il recettore e il farmaco è caratterizzata da altri due parametri: l' affinità del farmaco verso il sito di unione e l' efficacia del farmaco, cioè l'abilità del farmaco di attivare il meccanismo effettore o trigger, quando avviene l'unione tra il ligando e il sito di legame ² .

Da studi condotti in più laboratori da più di 20 anni è ben chiara l'esistenza di 3 tipi di recettori oppioidi: m , d , k . Per questi recettori sono stati clonati i geni ^3,4,5 . E' stata stimata una relativa densità dei siti di legame per i recettori m , d , k a livello delle lamine I e II del midollo spinale ma, fra tutti, i recettori m sono quelli più abbondanti; essi rappresentano circa il 70%, i recettori d il 24%, e i recettori k il 6% dei siti di legame per gli oppioidi nel midollo spinale nel ratto. I recettori per gli oppioidi sono attivati dai peptidi oppioidi endogeni, che includono le encefaline, le endorfine, le dinorfine e la normorfina. Esistono vari sottotipi di recettori per gli oppioidi, poiché si conoscono solo 3 geni; si pensa a questi recettori come proteine diverse, ma codificate da un solo gene attraverso un meccanismo di “splicing alternativo”.

Tutti i recettori oppioidi clonati hanno la stessa struttura generale (fig. 2; fig.3) con la regione N-terminale extracellulare, sette domini transmembrana e la regione C-terminale intracellulare. Ci sono evidenze farmacologiche dell'esistenza di nuovi recettori ( e , l , z ).

Sottotipi dei recettori oppioidi:

Il gene MOR1, che codifica per una forma del recettore m , dimostra un'omologia del 50-70% con i geni, che codificano per il recettore d (DOR1), k (KOR1) e ORL1. Sono state clonate due varianti del gene MOR1, che differiscono solo per la presenza di 8 aminoacidi nella catena C-terminale.

La suddivisione in m 1 / m 2 fu proposta da Pasternak per spiegare le sue osservazioni, derivate da studi con ligandi radioattivi. Il Naloxazone abolisce il legame di ogni radioligando al sito m 1 ; con studi in vivo si è osservato che il naloxazone blocca selettivamente l'antinocicezione indotta dalla morfina, ma non blocca la depressione respiratoria o l'induzione alla dipendenza ^6,7 .

Molte osservazioni suggeriscono l'esistenza di una nuova forma di recettore m , al quale si legherebbero analoghi della morfina con sostituzioni in posizione 6 (es. morfina6-glucuronide, eroina e 6-acetilmorfina), ma con il quale la morfina stessa non interagisce. Questi analoghi della morfina non interagiscono attraverso il legame ai recettori d o k poiché l'antinocicezione che essi inducono non è bloccata da antagonisti selettivi dei recettori d o k .

Recentemente è stato riportato che la morfina6-glucuronide, ma non la morfina, produce anche antinocicezione nel MOR1 mutante, prodotto per trascrizione alternativa del gene MOR1 nella regione exon1 ⁸ . Per il recettore d il gene DOR1 è il solo clonato, sebbene sia stata proposta la suddivisione del recettore d in d 1 / d 2 sulla base di esperimenti farmacologici. Vi sono poche evidenze per la teoria che differenti geni codificano i differenti sottotipi dei recettori m , d , k ; questi sottotipi possono essere il risultato di modificazioni post-trascrizionali del prodotto genico (glicosilazione, fosforilazione etc..); di dimerizzazione del recettore a una forma monomerica ⁹ o complessi eteromerici, o di interazione del prodotto genico con proteine associate ^10,11,12 .

Con l'estensione della conoscenza del genoma umano e delle librerie del cDNA nell'ambito dell'identificazione dei sottotipi dei recettori oppioidi “classici”, si è arrivati all'identificazione di un nuovo recettore con elevato grado di omologia con i recettori oppioidi “classici” detto ORL1 (opioid receptor-like). Sebbene l'ORL1 sia stato accettato come un membro della famiglia dei recettori oppioidi sulla base della sua omologia strutturale, non esiste una corrispondente omologia farmacologica. Il recettore ORL1 risponde agli agonisti endogeni nocicettivi, ma dimostra un profilo farmacologico, che differisce molto dai recettori m , d , k .

I ligandi non selettivi, che hanno un'alta affinità per i recettori m , d e k , hanno un'affinità invece molto bassa per il recettore ORL1; si tratta dunque di un cDNA, che codifica per un recettore il quale, per l'assenza di un ligando endogeno selettivo, è stato chiamato “orfano”.

La comparazione delle sequenze aminoacidiche dei quattro recettori chiarisce le differenze strutturali, che possono spiegare l'anormalità farmacologica. Ci sono infatti siti, posti vicino alla regione più alta di ogni regione transmembrana, che sono conservati nei recettori m , d , k , ma sono alterati nel recettore ORL1. I ligandi selettivi attualmente identificati per il recettore ORL1 sono pochi; accanto al naturale eptadecapeptide agonista nociceptina/orfanina FQ ¹³ , esistono altri peptidi ancora non completamente conosciuti. Sebbene i risultati di alcuni studi siano stati interpretati con l'esistenza di sottotipi del recettore ORL1, questa conclusione è ancora troppo prematura; la mancanza dell'antagonista specifico per questo recettore ne rende difficile l'identificazione farmacologica.

Infine, sebbene classificato come tale, il recettore s non è un recettore oppioide, ma rappresenta un recettore per un'altra classe di farmaci: la penciclidina (PCP) e i suoi analoghi, le fenilciclidine, che bloccano i canali ionici associati ai recettori N-metil-D-aspartato (NMDA). ¹⁴

Tutti i recettori oppioidi mediano la gran parte dei loro effetti cellulari attraverso l'attivazione di proteine G eterotrimeriche, di cui esistono vari sottotipi. I recettori m e k agiscono attivando preferenzialmente le proteine G 0 e G i2 , ma si accoppiano in modo più efficiente alla G 16 ¹⁴ . Si pensava originariamente che il complesso dei recettori m e d con le proteine G 1 /G 0 attivasse un aumento della conduttanza al K e l'inibizione dei canali del Ca voltaggio dipendenti, mentre i recettori k erano responsabili solo dell'inibizione dei canali del Ca voltaggio-dipendenti; si sa invece ora che i recettori k , in alcuni tipi di cellule, attivano anche i canali del K ¹⁵ .

Il recettore ORL1 avrebbe lo stesso sistema effettore degli altri recettori oppioidi, ma vi sono alcune evidenze per cui recettori oppioidi, particolarmente i recettori m e ORL1, potrebbero anche accoppiarsi ad effettori cellulari in maniera indipendente dalle proteine G ¹⁶ . In genere, le conseguenze dell'attivazione di qualsiasi recettore oppioide in un dato tipo cellulare dipendono più dal profilo (stechiometria) delle proteine G e degli effettori espressi, che dal tipo di recettore presente sulla cellula (fig.4), ma va comunque notato che differenti tipi di recettore oppioide intrinsecamente si accoppiano in via preferenziale ad un tipo di effettore specifico.

I recettori m , di cui esistono molte sottoclassi, mediano l'analgesia sovraspinale, l'euforia, la depressione respiratoria, la stipsi, il prurito, la ritenzione urinaria, la nausea e il vomito, nonché la dipendenza fisica; i recettori d inducono l'analgesia spinale; i recettori k mediano l'analgesia spinale, la miosi, la sedazione. Per ottenere l'effetto farmacologico, almeno un certo numero di recettori deve essere attivato dall'oppioide ¹ .

Differenti tipi di molecole agoniste, pur agendo sullo stesso tipo di recettore, devono attivare una diversa quantità di essi per ottenere lo stesso effetto neuronale. Un esempio è dato da due oppioidi: morfina e fentanile. La morfina deve attivare un numero maggiore di recettori m , rispetto al fontanile, per causare l'effetto inibitorio finale. La morfina quindi ha un' efficacia minore rispetto al fentanile per i recettori m ¹ . Questo concetto di efficacia è importante per spiegare alcune delle osservazioni cliniche legate alla tolleranza ¹ .

Quando un recettore è esposto a continua interazione con le molecole di uno specifico oppioide, per esempio la morfina, la parte della molecola, coinvolta nello scatenamento delle reazioni biochimiche a cascata, può diventare inattiva, cosicché l'unione dell'oppioide con il sito recettoriale non è seguito da alcuna reazione. Questi recettori sono detti silenti, cioè incapaci di attivare la traduzione e quindi indurre l'effetto neuronale finale ¹ . Quando un'elevata percentuale di recettori diventa silente, la probabilità che molecole di oppioidi interagiscano con recettori attivi si riduce, a meno che un numero maggiore di molecole (cioè un'aumentata dose di farmaco) possa unirsi con essi.

Dal momento che oppioidi a bassa affinità devono interagire con un numero maggiore di recettori attivi, questi farmaci diverranno inefficaci prima di quelli ad alta affinità. Questo concetto può essere utilizzato clinicamente per trattare quei pazienti, che sono divenuti tolleranti ad un oppioide ad affinità minore.

Un altro importante fenomeno, di cui si deve tener conto nella pratica clinica, è quello dello sviluppo della dipendenza, alla cui base, dal punto di vista molecolare, ci sarebbero 2 fenomeni ^1,17 :

a) desensibilizzazione del recettore (per disaccoppiamento dalla proteina G),

b) scomparsa del recettore.

L'internalizzazione del complesso recettore-proteina G dipende da molti criteri, che includono l'affinità del farmaco al suo recettore e lo stato di interazione recettore-proteina G. Recenti studi rivelano l'esistenza di componenti citosolici, come la fosducina e la b -arrestina, che interferiscono con l 'internalizzazione del recettore ; la fosducina determina la fosforilazione del recettore e la b -arrestina stimola l'endocitosi attraverso la dissociazione del complesso recettore-proteina G. L'azione di queste proteine è stata studiata su cellule neuronali ibride, che esprimono recettori oppioidi m , rendendo questi recettori fluorescenti attraverso la fusione con proteine capaci di emettere fluorescenza verde ¹⁸ . Al fenomeno della dipendenza si deve la necessità di aumentare il dosaggio di morfina per mantenere un controllo costante sul dolore. Nasce da ciò il nostro obiettivo di valutare eventuali variazioni dei metaboliti della morfina, nel trattamento cronico, e la loro possibile influenza sulla risposta al dolore.

MATERIALI E METODI

I campioni urinari sono stati ottenuti da un gruppo di 6 pazienti (2 uomini e 4 donne di età media 57,6 aa) con dolore cronico da patologia neoplastica avanzata, dopo aver ottenuto il loro consenso a partecipare allo studio (Tabella I). Sono stati esclusi dallo studio pazienti con insufficienza epatica e renale.

Questi pazienti sono stati trattati con morfina a rilascio controllato (MS-Contin) al dosaggio medio di 33,3 mg/die al primo giorno fino a raggiungere un dosaggio medio di 60 mg/die nella prima settimana, e di 75 mg/die nelle seconda settimana. I campioni urinari sono stati prelevati a 24h, 7 giorni e 15 giorni dall'inizio del trattamento valutando anche dati biochimici plasmatici quali: creatininemia, azotemia, transaminasi, fosfatasi alcalina, g GT, albuminemia, protidemia, bilirubinemia.

La risposta antalgica al trattamento con morfina è stata valutata come variazione della risposta al dolore, secondo il metodo del Visual Analogic Scale (VAS). Sui campioni urinari è stata dosata la concentrazione dei metaboliti della morfina M3G e M6G con metodo cromatografico in HPLC per ogni singolo paziente, valutando per tutti la concentrazione di morfina, il rapporto dei metaboliti con la morfina (M3G/morfina; M6G/morfina) e il rapporto tra i due metaboliti (M3G/M6G), considerando valori non significativi per p < 0.05.

Metodo Analitico

I campioni di urina sono stati sottoposti ad una prima fase di estrazione solida (Solid Phase Extration SPE) su colonne di LiChrolut TSC (200mg) (Merck) in accordo con le procedure riportate da Wielbo et al ²⁷ . La morfina idrocloridrato e la morfina-3 b -glucuronide provengono da Salars (Como, Italy); la morfina-6 b -glucuronide è stata ottenuta da Sigma-Aldrich (Milano,Italy). Tutti i solventi sono stati gradati in HPLC (Merck, Darmstadt, Germany).

Le colonne sono state condizionate con metanolo (3ml), seguito da acqua (3ml) e fosfato (0.01 M pH 3.0). I campioni sono stati applicati lentamente sulla colonna, che è stata poi lavata con fosfato (10 mM, pH 3.0) e metanolo. Gli analiti sono stati lavati con 3 ml di ammoniaca 2% metanolo. Gli eluati sono stati fatti evaporare a secco a 37° C sotto una corrente di nitrogeno. Il residuo è stato dissolto in metanolo e portato a 4° C, finché non è stata avviata l'analisi in HPLC.

High performance liquid chromatography.

L'analisi HPLC è stata effettuata usando un HPLC Hitachi Merck equipaggiato con campionamento automatico (Model L-7250), pompa (Model L-7100) e un sensore di fluorescenza (Model L-7480). I dati sono stati conservati e processati da un personal computer con software appropriato. La separazione è stata effettuata su un LiChrocart-Purospher 100 RP-18 5 m m, 250X 4mm con precolonna LiChrocart-LiCrospher 100 RP-18-5 m m, 4x4mm (merck); in accordo con le procedure riportate da Huwyler et al ²⁸ , la fase mobile è stata ottenuta da un gradiente lineare (6.4-20% rispetto all'acetonitrile), formato dalla combinazione di 200 mM di fosfato di potassio, pH3 (eluato A) e acetonitrile- 200mM fosfato di potassio, pH 3 20:80 (v/v) (eluato B). La velocità della pompa è stata di 0.8ml/min e il volume di iniezione di 20 m l. La morfina e i glucuronidi della morfina sono stati monitorati attraverso il sensore di fluorescenza (onde di eccitazione ad una lunghezza d'onda di 210 nm, emissione ad una lunghezza d'onda di 350 nm). Il limite di quantità di tutti e tre gli analiti è stato di 20ng/ml.

RISULTATI

Con il metodo HPLC, sono stati ottenuti i valori di concentrazione urinaria della morfina e dei suoi metaboliti glucuronizzati: morfina-3-glucuronide e morfina-6-glucuronide.

I risultati ottenuti sono illustrati nella tabella II, dove è possibile valutare le correlazioni dei valori di concentrazione urinaria di morfina; il rapporto M3G/morfina e M6G/morfina, il rapporto M3G/M6G, in ogni singolo soggetto nei tre tempi di prelievo dei campioni urinari: dopo 24 ore dall'inizio del trattamento, dopo 7 giorni e dopo 15 giorni.

La concentrazione urinaria media di morfina, calcolata nei tre tempi (tab. II; grafico 1), è stata del valore di 674,33 ng/ml dopo 24 ore dal trattamento, con dosaggio medio di morfina di 33,3 mg/die; dopo 7 giorni la concentrazione urinaria media di morfina è stata di 555,16 ng/ml, con un dosaggio medio a 7 giorni di 60 mg/die; dopo 15 giorni la concentrazione media urinaria di morfina è stata di 486,5 ng/ml, con dosaggio medio a 15 giorni di 75 mg/die.

Per quanto riguarda i valori dei metaboliti, questi sono stati valutati in correlazione con la morfina come rapporto tra metabolita e morfina e tra i metaboliti stessi (M3G/M6G). Nella tabella II (grafico 2) sono riportati i valori medi del rapporto M3G/morfina nelle urine; dopo 24 ore dal trattamento troviamo un rapporto medio M3G/morfina di 6,30 ng/ml; dopo 7 giorni dal trattamento il rapporto è stato di 8,70 ng/ml; dopo 15 giorni di 7,10 ng/ml.

Per quanto riguarda il rapporto M6G/morfina (grafico 3), i valori medi sono stati di 1,66 ng/ml dopo 24 ore dal trattamento e di 1,89 ng/ml dopo 15 giorni dal trattamento. I valori medi del rapporto tra i metaboliti M3G/M6G (grafico 4) sono stati di 4,27 ng/ml dopo 24 ore dal trattamento; 4,35 ng/ml dopo 7 giorni, e di 4,34 dopo 15 giorni.

Le differenze tra le medie sono state considerate non significative per p< 0,05.

DISCUSSIONE

Dal punto di vista clinico, con la valutazione della risposta antalgica al trattamento con morfina, abbiamo riscontrato una risposta soddisfacente al trattamento morfinico in 4 soggetti con un VAS iniziale di 10. Il VAS a 15 giorni dal trattamento si è ridotto a valori tra 4-5. Di contro, in 2 soggetti, abbiamo riscontrato una bassa risposta al trattamento morfinico.

In tutti i soggetti, la risposta al trattamento morfinico si è mantenuta nel tempo grazie all'aumento graduale del dosaggio della morfina per via orale. Nei soggetti in cui la risposta si è mantenuta bassa, si è provveduto a cambiare terapia. La necessità di aumentare la posologia per il mantenimento della risposta antalgica rientra nel concetto di tolleranza, di cui si è precedentemente discusso.

Sui soggetti in trattamento cronico con morfina, si è voluto testare l'ipotesi di un contributo significativo all'analgesia del metabolita attivo della morfina, cioè l'M6G ^31,32 . Studi sull'attività farmacologica del metabolita attivo della morfina, la M6G, hanno suggerito che parte degli effetti clinici del trattamento morfinico dopo somministrazione orale potrebbero essere mediati dai metaboliti attivi ^29,31 .

La quantità di M6G, prodotta dal metabolismo della morfina, è in genere inferiore alla quantità di M3G, metabolita inattivo. Abbiamo voluto valutare se, nei soggetti in trattamento cronico con morfina, potesse esservi una variazione del rapporto dei metaboliti M6G/M3G a favore dell'M6G.

La correlazione dei nostri dati con un gruppo di studio, dello stesso Istituto di Farmacologia, sulle concentrazioni plasmatiche dei metaboliti della morfina nei soggetti in trattamento acuto (postoperatorio) con morfina, mostra che, anche a livello plasmatico, la concentrazione dei metaboliti è paragonabile a quella urinaria (grafico 5). La dimostrazione del potenziale contributo della M6G all'analgesia, che si ha dopo trattamento morfinico, determinerebbe profonde implicazioni. In questo caso esisterebbe la possibilità che la M6G possa ridurre la tendenza a sviluppare alcuni effetti tossici, che accompagnano la terapia morfinica. La ridotta liposolubilità di questo metabolita potrebbe essere sufficiente a prevenire lo sviluppo di effetti tossici nervosi centrali. Sono queste tutte ipotesi, cui non è ancora possibile associare dei dati precisi ed univoci di conferma.

Tuttavia, dai risultati della nostra casistica, facilmente valutabili in tabella II, non sono emersi dati statisticamente significativi circa variazioni del metabolismo della morfina; è ben evidente che il rapporto M3G/M6G rimane costante nei campioni urinari nei tre tempi del trattamento, in cui sono stati effettuati i prelievi; (valori medi 4,27-4,35-4,34 rispettivamente nei campioni dopo 24 ore, 7 giorni e 15 giorni dal trattamento).

La concentrazione di M3G escreto nelle urine resta superiore a quelle dell'M6G (in accordo con la letteratura mondiale); concentrazioni che restano costanti nel tempo, in accordo con l'aumento della posologia, potendo affermare, quindi, che non vi sono stati fenomeni di tolleranza, dovuti a processi di metabolizzazione della morfina. La formazione di M6G nei nostri soggetti non ha influenzato l'andamento del dolore. Variazioni della produzione dei metaboliti sono state osservate, invece, in soggetti che fanno uso di eroina, in cui, secondo i dati preliminari, vi sarebbe un'inversione del rapporto M3G/M6G.

Per questa ragione, le nostre osservazioni risulteranno molto utili, in uno studio molto più ampio, come gruppo di controllo vs soggetti che assumono eroina, al fine di migliorare la conoscenza della farmacodinamica degli oppioidi e del loro metabolismo. Tutto ciò permetterà in futuro un migliore e sempre più razionale uso di questi importanti farmaci.

(UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “LA SAPIENZA” - Scuola di Specializzazione in ANESTESIA E RIANIMAZIONE)

Renzi Antonia  07/03/2005